課程內(nèi)容

《血紅蛋白的提取和分離》
本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)
體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理
1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法散緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用
2、主要原理：
①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理
2、主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理
②電泳法分離樣品的原理
③緩沖溶液的組成和作用機理
3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法
4、課題難點：
①樣品的處理
②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填
1、提問：用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？
雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。
2、提問：血液有哪些成分？
血液：血漿：水分
      固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等
血細(xì)胞：白細(xì)胞
        血小板
        紅細(xì)胞（最多）→血紅蛋白（90%）：兩個α—肽鍵
                                         兩個β—肽鍵
                                         四個亞鐵紅素集團(tuán)
血紅蛋白的特點：每個肽鍵環(huán)繞一個亞鐵血紅素基因，此基因可攜帶一個分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色
血紅蛋白：兩個α—肽鍵
          兩個β—肽鍵
          四個亞鐵紅素集團(tuán)
一、血紅蛋白的提取和分離1、分離生物大分子的基本思路
選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子
2、蛋白質(zhì)分離和提取的原理：
根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。
（一）凝膠色譜法（分配色譜法）
1、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進(jìn)行分離
2、凝膠：大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多空小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。
3、凝膠色譜法的原理
①但相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠使，相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；②而相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。③依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。
4、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程
a、相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)由于擴散作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部面被滯留，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過
b、（1）蛋白質(zhì)混合物上柱；（2）洗脫開始，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)擴散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)；相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)被排阻于顆粒之外；（3）相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)被滯留，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)向下移動；（4）相對分子質(zhì)量不同的分子完全分開；（5）相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)行程較短，已從層析柱中洗脫出來，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)還在進(jìn)行中。
（二）緩沖溶液
1、概念：在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值保持不變的混合溶液。
2、作用：能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變
3、緩沖溶液的配制：通常由1~2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。
提問：在本課題中使用的緩沖液是：磷酸緩沖液
其目的是：利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和科學(xué)研究（活性）
（三）電泳
1、概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程
2、原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。
3、類型：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。
二、實驗操作
（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟
樣品處理→粗分離→純化→純度堅定
（二）操作過程
1、樣品的處理：本課題可選用豬牛羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白
（1）紅細(xì)胞的洗滌：
①洗滌目的：去除雜蛋白，已利用后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少
②洗滌操作：1、采集血樣；2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。
（2）血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂），細(xì)胞劈裂釋放出血紅蛋白。
（3）分離血紅蛋白溶液：
①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第一層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第二層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第三層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第四層（最下層）：雜志沉淀（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。
（4）透析：
①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（PH為7.0），透析12小時
②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜志
2、凝膠色譜操作：
（1）凝膠色譜柱的制作：
①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需要砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)粉李不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。
（2）凝膠色譜柱的裝填
①凝膠的選擇：A：材料：交聯(lián)聚糖凝膠（G—75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸收7.5克。
②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。
③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。
④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（PH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)送洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。
（3）樣品加入與洗脫
①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降，到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。
②地價透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加氧=樣，同時注意不要破壞凝膠面
③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口
④洗脫：小心加入PH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。
⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）
⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。
思考下面的問題：
1、在血紅蛋白純化的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？
讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的PH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常
2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？
血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。
3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？
血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步：包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放，離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即：樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即：樣品的純化，最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。
教學(xué)反饋
1、凝膠色譜法是根據(jù)（B）分離蛋白質(zhì)的有效方法
A、分子的大小
B、相對分子質(zhì)量的大小
C、帶電荷的多少
D、溶解度
2、緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（B）基本不變
A、溫度
B、PH
C、滲透壓
D、氧氣濃度
3、電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷B的電極移動
A、相同
B、相反
C、相對
D、相向
4、哺乳動物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（A）與氧氣的運輸有關(guān)
A、血紅蛋白
B、肌紅蛋白
C、肌動蛋白
D、肌球蛋白
5、血液由血漿和各種血紅細(xì)胞組成，其中（C）的含量最多
A、白細(xì)胞
B、血小板
C、紅細(xì)胞
D、淋巴細(xì)胞
6、為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑（D）
A、NaCl
B、甲苯
C、蒸餾水
D、檸檬酸鈉
7、將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第三層是（C）
A、無色透明的甲苯層
B、脂溶性物質(zhì)的沉淀層
C、血紅蛋白的水溶液
D、其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物