課程內(nèi)容

《DNA的粗提取與鑒定》
一、基礎(chǔ)知識(shí)
（一）提取DNA的方法
1、提取生物大分子的基本思路
選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子
2、提取DNA的基本思路
利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分
3、DNA的溶解性
DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反
5、DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離
6、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性
①蛋白酶能水解蛋白值，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響
②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60-80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性
③洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，但對(duì)標(biāo)準(zhǔn)眉 性感眉 柳葉眉 不適合一字眉沒(méi)有影響
7、DNA的鑒定
①DNA與二苯胺（沸水浴）會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑
二、DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取
1、材料：魚(yú)卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌。（從中選取2~3種實(shí)驗(yàn)材料）
（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液
1、動(dòng)物細(xì)胞
動(dòng)物細(xì)胞的破碎交易，例如，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可
討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂
答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞漲裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA
2、植物細(xì)胞
①植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜
討論：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？
答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解
②實(shí)例：提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液
討論：如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？
答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物，用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等
（三）去除濾液中的雜質(zhì)
為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理
討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)
方案一 利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)，具體做法是：在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2mol/l，過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/l，析出DNA，過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì)，再用2mol/l的NaCl溶液溶解DNA。
方案二 直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)10-15min，能肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)
方案三  將濾液放在60-75℃的恒溫水浴箱中保溫10-15min，主義嚴(yán)格控制溫度范圍
討論：方案二與方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離
（四）DNA的析出與鑒定
1、DNA的析出
DNA的析出用的是濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2-3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水
2、DNA的鑒定
鑒定DNA時(shí)在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/l的NaCl溶液5ml于兩支試管中，其中一只只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化，看看溶液有DNA的溶液是否有藍(lán)色
四、課題成果評(píng)價(jià)
（一）是否提取出了DNA
貫徹你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備
練習(xí)
1、請(qǐng)解釋提取DNA的實(shí)驗(yàn)操作中主要的步驟的目的。
答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成果與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞被的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。
2、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特點(diǎn)的蛋白質(zhì)與提取DNA一樣容易嗎？
答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大，這是因?yàn)?，與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)穩(wěn)定、鹽濃度、pH等條件要敏感的多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，職能根據(jù)特點(diǎn)蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。
1、在DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是（B）
A、稀釋血液、沖洗樣品
B、使血紅細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出
C、使血紅細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量
D、使血紅細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA
2、實(shí)驗(yàn)中NaCl的物質(zhì)的量濃度為2mol/l和0.14mol/l對(duì)DNA有何影響？
3、DNA遇二苯胺（沸水?。?huì)染色（D）
A、磚紅色
B、橘黃色
C、紫色
D、藍(lán)色
4、提取雞血中的DNA時(shí)，為什么要出去血液中的上清液？
答：DNA的提取，關(guān)鍵是對(duì)雜質(zhì)的去除，由于上清液是血液中的血漿部分，不含DNA，所以要除去上清液（含有蛋白質(zhì)）。