課程內(nèi)容

《分解纖維素的微生物的分離》
（一）纖維素與纖維素酶
纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。地球上含量最豐富的多糖。
纖維素酶：由微生物分泌的一種復合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。
纖維素—→（C1酶、Cx酶）—→纖維二糖—→（葡萄糖、苷酶）—→葡萄糖
實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗
①取二支20ml的試管
②各加入一張濾紙條
③各加入PH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液11ml和10ml
④在乙試管中加入1ml纖維素酶
⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上震蕩1h
⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失
（二）纖維素分解菌的篩選
剛果紅染色法
剛果紅能與纖維素形成紅色復合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。
用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時，如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)已菌落為中心的透明圈時，可說明該菌落是纖維素分解菌，因為它已將被剛果紅染成紅色的纖維素分解了。
一、實驗設(shè)計
請你更加實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個詳細的實驗方案。
土壤取樣—→選擇培養(yǎng)—→梯度稀釋—→將樣品涂布的鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上—→篩選產(chǎn)生透明圈的菌落
1、本實驗的流程與課題2中的試驗流程有哪些異同？
本實驗流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。
2、為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？
由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。
3、將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋進土壤多深？
將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。
閱讀與思考  閱讀教材28-29頁“資料一”“資料三”并思考相關(guān)問題
問題一：是液體培養(yǎng)基，因為沒有添加瓊脂
問題二：具有篩選作用，因為培養(yǎng)基中的碳源是纖維素，該培養(yǎng)基只有能分泌纖維素酶的纖維素分解菌才能生長。
問題三：“資料三”中的兩種方法各有哪些優(yōu)點和不足，你打算選哪一種？
剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應(yīng)用已經(jīng)超過有20年的歷史，在本課題中我們給出了兩種方法。方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點是這樣顯示的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜的問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反映。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。
問題四：為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？
在選著培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。
二、實驗案例
土壤中纖維素分解菌的分離
1、土樣采集：土樣采集的方法與本專題課題2類似。土樣的此埃及要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。
2、選擇培養(yǎng)：選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250ml錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1ml和10,ml的移液管、天平、搖床、溫度計等
在250ml錐形瓶中裝入30ml選擇培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙，用線繩扎緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。
選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30ml培養(yǎng)基的搖瓶中，將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1-2d，至培養(yǎng)基變渾濁，重復上述方法再培養(yǎng)一次，然后再進行梯度稀釋和涂布平板。
3、剛果紅染色法分離：纖維素分解菌這一步所需要的儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1ml移液管，裝有9ml無菌水的20ml大試管，溫箱等。
培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在50ml三角瓶中裝入200ml培養(yǎng)基，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。
倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作的要求，在無菌的培養(yǎng)皿中倒入15~20ml培養(yǎng)基，凝固后待用。
制備菌懸液：按照本專題課題1的稀釋操作方法，將選著培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)至10^6。
涂布平板：將稀釋度數(shù)為10^4~10^6的菌懸液各取0.1ml，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30℃倒置培養(yǎng)，至菌落長出。每個稀釋度下需涂布3個平板，并注意設(shè)置對照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本[資料三]。
三、結(jié)果分析與解釋
1、培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落
對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格，如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。
2、分離的結(jié)果是否一致
由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌，但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。
土壤取樣—→選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌數(shù)量的多少來確定）—→梯度稀釋—→將菌懸液涂布到特定選擇作用的培養(yǎng)基上—→挑選單菌落—→發(fā)酵培養(yǎng)