課程內(nèi)容
《酵母細(xì)胞的固定化》
一、課題目標(biāo)
1、簡述固定化酶的概念
2、說出酶固定化的方法
3、嘗試用包埋法植被固定化酵母細(xì)胞
4、探討固定化酶的應(yīng)用價值
固定化酶
將分離提純后的酶固定到一定的載體上，使用時將固定的酶投放到反應(yīng)溶液中，催化反應(yīng)結(jié)束后，又能將被固定的酶回收，這樣的酶叫做固定化酶。
基礎(chǔ)知識
（一）固定化酶的應(yīng)用實例
1、利用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)高果糖漿的實例
（1）高果糖漿的生產(chǎn)需要酶葡萄糖異構(gòu)酶
（2）葡萄糖異構(gòu)酶的優(yōu)點
穩(wěn)定性好、可以持續(xù)發(fā)揮作用
（3）在生產(chǎn)中直接使用酶有什么缺點？
酶溶解于葡萄糖溶液后，無法回收，造成浪費
2、固定化酶的反應(yīng)柱示意圖
使用固定化酶技術(shù)，將葡萄糖異構(gòu)酶固定在一種顆粒狀的載體上，再將這種酶顆粒裝在一個反應(yīng)柱內(nèi)，柱子底端裝有分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板上的小孔，而反應(yīng)溶液卻可以自由出入。
3、固定化酶的生產(chǎn)實踐中的優(yōu)點：
反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量
酶既能與反應(yīng)物接觸，又容易與產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量；同時固定在載體上的酶還可以反復(fù)利用，節(jié)約成本。
4、固定化酶的其他應(yīng)用實例
采用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)L-氨基酸。1969年，日本利用固定化氨基酰酶，由乙酰化-DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸獲得成功。是世界上固定化酶大規(guī)模應(yīng)用的首例。
1974年以來，已能將曲霉的安氨基?；腹潭ㄔ贒EAE-Sphadex上生產(chǎn)出L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸等。工業(yè)成本降低約40%，產(chǎn)品廣泛用于食品、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等。
用于化驗診斷。能夠化驗血糖數(shù)值的血糖快速測試儀。血糖快速測試儀實際上是利用有關(guān)的固定化酶制成的一種傳感器。酶傳感器主要是由固定化酶膜和交換器組成：固定化酶膜可以選擇性的“識別”被檢測的物質(zhì)，并催化被“識別”出的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；交換器則把這一催化反應(yīng)中產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號，進(jìn)而通過儀表顯示出來。
酶傳感器還可以用于水質(zhì)監(jiān)測。例如，酚是一類對人體有害的化合物，科學(xué)家利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶傳感器，可以快速測定出水中質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅有2×10^-7的酚
（二）固定化細(xì)胞技術(shù)
（1）固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)。
（2）包括包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法
（3）酶適合采用化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法固定化，而細(xì)胞多采用包埋法固定化。這是因為細(xì)胞個大，而份分子很?。粋€大的細(xì)胞難以被吸附或結(jié)合，而個小的酶容易從包買材料中漏出
（4）酶的幾種固定方式
（1）包埋法：將酶包埋在細(xì)微網(wǎng)格里
（2）化學(xué)結(jié)合：法將酶相互連接起來
（3）物理吸附法：將酶吸附在載體表面上
（5）包埋法固定化細(xì)胞
固定化細(xì)胞是指固定在一定空間范圍內(nèi)、能夠進(jìn)行生命活動的并且可以反復(fù)使用的活細(xì)胞。固定化細(xì)胞技術(shù)主要應(yīng)用在一些需要紅細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)的處理的生產(chǎn)過程，大多數(shù)與微生物有密切的關(guān)系，如酒精的生產(chǎn)、污水的處理等。
包埋法固定化細(xì)胞是將微生物細(xì)胞均勻包埋在不溶于水的多孔性載體中。
常用的載體有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維和聚丙烯酰胺等。
2、固定化酶和固定化細(xì)胞的聯(lián)系與區(qū)別
聯(lián)系：都是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)。在生產(chǎn)中都容易與產(chǎn)物分離，固定在載體上的酶或細(xì)胞可以反復(fù)利用。
區(qū)別：適宜的固定方法不同；固定化細(xì)胞技術(shù)更適宜于生產(chǎn)實際。
1）固定化細(xì)胞技術(shù)操作容易，成本低，容易回收；
2）固定化細(xì)胞技術(shù)對酶活性影響更?。?br>
3）固定化細(xì)胞固定的是一系列酶
4）由于大分子難以通過細(xì)胞膜，因此固定化細(xì)胞的應(yīng)用有一定的限制；
實驗操作
（一）制備固定化酵母細(xì)胞
酵母細(xì)胞的活化
在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)。活化就是讓休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短，一般需要0.5~1h。此外，酵母細(xì)胞活化時體積會變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。
2、配制物質(zhì)的量濃度為0.05mol/l的CaCl2溶液
CaCl2的作用是使海藻酸鈉膠體發(fā)生聚沉，形成凝膠珠
3、配制海藻酸鈉的溶液
注意加熱時要用小火，或者間斷加熱，反復(fù)幾次，直到海藻酸鈉融化為止。加熱使海藻酸鈉溶液是操作中最重要的一環(huán)。海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少，影響實驗效果。
4、海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合
將海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入活化酵母細(xì)胞，充分?jǐn)嚢瑁D(zhuǎn)移至注射器。
5、固定化酵母細(xì)胞
以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl2溶液中，滴加在CaCl2溶液中形成凝膠珠，凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30分鐘。
剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法，一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。
實驗操作
（二）用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵
1、將固定化的酵母細(xì)胞（凝膠珠0用蒸餾水沖洗2到3次。
2、將150ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移到200ml的錐形瓶中，再加入固定好的酵母細(xì)胞，置于25攝氏度下發(fā)酵24h。
利用固定化酵母細(xì)胞產(chǎn)生酒精，可以看到產(chǎn)生了很多氣泡，同時會聞到酒味。
細(xì)胞的固定化要在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行；反復(fù)使用固定化酵母細(xì)胞時，需要避免微生物的污染。
在應(yīng)用固定化酵母細(xì)胞時，需要避免微生物的污染。
在應(yīng)用固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行酒精發(fā)酵時要注意控制好溫度，保證缺氧的環(huán)境，并且發(fā)酵時間要稍長一些，增強實驗效果。
練習(xí)1：直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化細(xì)胞催化反應(yīng)，各有哪些優(yōu)點和不足？
| 類型 | 優(yōu)點 | 不足 |
| 直接使用酶 | 催化效率高，低耗能、低污染 | 對環(huán)境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后酶會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。 |
| 固定化酶 | 酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與反應(yīng)物分離，同時固定在載體上的酶還可以被反復(fù)利用。 | 一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，而在生產(chǎn)實踐中很多產(chǎn)物的形成都通過一系列的酶促反應(yīng)才能得到。 |
| 固定化細(xì)胞 | 成本低，操作更容易 | 固定后的細(xì)胞與反應(yīng)物不容易接近，可能導(dǎo)致反應(yīng)效果下降。 |
A、固定化酶技術(shù)就是固定反應(yīng)物，將酶依附著載體圍繞反應(yīng)物旋轉(zhuǎn)的技術(shù)
B、固定化酶的優(yōu)勢在于能催化一系列的酶促反應(yīng)
C、固定化酶中的酶無法重復(fù)利用
D、固定化酶是將美固定在一定空間的技術(shù)
2、在制備固定化酵母細(xì)胞的過程中，CaCl2溶液的作用是（C）
A、用于調(diào)節(jié)溶液的PH
B、用于進(jìn)行離子交換
C、用于膠體聚沉
D、用于為酵母菌提供鈣離子
3、下列不屬于固定化酶在利用時的特點是（C）
A、有利于酶與產(chǎn)物分離
B、可以被反復(fù)利用
C、能自由出入依附的載體
D、一種固定化酶一般情況下不能催化一系列酶促反應(yīng)
例4 下列關(guān)于固定化酶酵母細(xì)胞制備步驟不恰當(dāng)?shù)氖牵–）
A、應(yīng)使干酵母與水混合并攪拌，以利用酵母菌活化
B、配置海藻酸鈉溶液時要用小火間斷加熱的方法
C、向剛?cè)诨玫暮Ｔ逅徕c溶液中加入已活化的酵母細(xì)胞，充分?jǐn)嚢璨⒒旌暇鶆?br> D、將與酵母混合的海藻酸鈉液滴加入CaCl2溶液中，會觀察到CaCl2溶液中有球形或橢球形的凝膠珠形成
