課程內(nèi)容

《多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷》
一、基礎(chǔ)知識
（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)
1、組成元素
C、H、O、N、P
2、基本單位
脫氧核苷酸
3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)
脫氧核苷酸：磷酸
            脫氧核苷：脫氧核糖
            含氮堿基：嘌呤：腺嘌呤（A）
                      鳥嘌呤（G）
                      嘧啶：胞嘧啶（C）
                      胸腺嘧啶（T）
4、多脫氧核苷酸鏈的形成
一個核苷酸上的磷酸基團上的“-OH”和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羧基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’、5’、；磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羧基“-OH”末端稱為3'端，而磷酸基團的末端稱為5'端
5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)
①DNA分子是由兩條反相平行的（即一條鏈為3'-5'，另一條鏈為5'-3'）脫氧核苷酸鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)
②脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)
③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對
6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算
規(guī)律：DNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等。任意兩個互補的堿基之間和相等即A=T,G=C。任意兩個不互補的堿基之和恒等，占堿基總數(shù)的50%。及：A+G=T+C=T+G=50%,(A+G)/(T+C)=(A+C)/(G+T)=(T+C)/(A+G)=1
規(guī)律二：在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補鏈的(A+G)/(T+C)的值互為倒數(shù)關(guān)系
規(guī)律三：DNA雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與整個DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等
（二）DNA分子的特性
1、穩(wěn)定性
在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，通過氫鍵形成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來。）
2、多樣性
構(gòu)成DNA分子的堿基對的數(shù)量不同，堿基對的排列順序千變?nèi)f化
3、特異性
不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在差異，因此每一個DNA分子的堿基對都有其特點的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的
（三）DNA的復(fù)制
1、概念
由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程
2、時期
有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期
3、場所
細胞核（主）、線粒體、葉綠體
4、模板
DNA母鏈
5、原材料
脫氧核苷酸
6、基本條件
酶、ATP、原料、模板
7、復(fù)制過程
①解旋
②合成
③復(fù)旋
①解旋提供準確模板
條件：ATP供能  解旋酶
解開的兩條單鏈叫母鏈（模板鏈）
②合成互補子鏈
模板：兩條母鏈
原料：游離的4種脫氧核苷酸
酶：合成酶
原則：堿基互補配對原則
③子、母鏈結(jié)合盤繞形成新DNA分子：
8、復(fù)制特點
邊解旋邊復(fù)制（過程）
半保留復(fù)制（結(jié)果）
9、遵循原則
堿基互補配對原則
10、精確復(fù)制的原因
①規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板
②堿基互補配對能力保證了復(fù)制準確無誤的進行
11、復(fù)制的意義
DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性
（四）PCR（多聚酶鏈式反應(yīng)）
1、DNA聚合酶特性
不能從頭合成DNA，只能從DNA的3'端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物
2、DNA聚合酶作用過程
當(dāng)引物與DNS母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3'端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5'端向3'端延伸
3、PCR原理
①在80-100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性
②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈
③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器
4、Taq DNA聚合酶的應(yīng)用
高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化
5、緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)
DNA模板，分別與兩套模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNS聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行
6、PCR技術(shù)的特點
PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好。易自動化等突出特點
7、細胞內(nèi)和細胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別

體內(nèi)DNA的復(fù)制		體外的模擬
模板（母鏈）	細胞內(nèi)源	外源加入
引物	引物合成酶	外源加入
底物dNTP	細胞內(nèi)源	外源加入
聚合酶	細胞內(nèi)源	外源加入
反應(yīng)環(huán)境	細胞內(nèi)環(huán)境	緩沖液

8、細胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點
①PCR過程需要的引物一般是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20-30個脫氧核苷酸
②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的
（五）PCR的反應(yīng)過程
1、PCR的反應(yīng)步驟
PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟——變性、復(fù)性和延伸
2、循環(huán)過程
①變性（模板DNA解旋）
模板DNA經(jīng)加熱至90℃以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備
PCR循環(huán)第一步：加熱變性
②復(fù)性（退火）
模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到50℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合
PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火
③模板DNA-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈
PCR循環(huán)第三步：引物延伸
第一個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列
3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量
4、PCR循環(huán)的結(jié)果
①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行Ⅰ的延伸
②DNA聚合酶只能在特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。
二、PCR的實驗操作
（一）設(shè)備及用具
1、PCR儀
實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器
2、微量離心管
一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml
3、微量移液器
用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次
（二）實驗操作步驟
1、準備
按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上
2、移液
用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑
3、混合
①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁
②注意：A離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢
B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻
4、；離心
①過程：將微量離心管放在離心機上，離心約10s
②離心目的：使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果
5、反應(yīng)：
將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。

循環(huán)數(shù)	變性	復(fù)性	延伸
第一次	94℃ 10min	-	-
30次	94℃ 30s	55℃,30s	72℃ 1min
最后一次	94℃ 1min	55℃,30s	72℃ 1min

6、注意事項
PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外援DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：
①隔離操作區(qū)：所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；
②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭
三、課題成果評價
（一）理論上DNA擴增的計算
1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2的n次方
2、a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a乘以2的n次方
（二）實驗中1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2的n次方含量的測定
1、原理
可以通過計算1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA含量評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)
2、過程
①稀釋
PCR反應(yīng)液，加入98ul蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋
②對照凋零
以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)至零
③計算
取DNA稀釋液100ul至比色杯中，測定260nm處的光吸收值
④計算
DNA含量（ug）=50×（260nm的讀數(shù)）
                  ×稀釋倍數(shù)
50:1ug/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02
五、實驗小結(jié)
PCR儀加熱使（模板）變性，復(fù)性使引物與模板DNA（互補），延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫（72℃），在（Taq聚合酶）的作用下，以四種脫氧核苷酸為原料，以（引物）為復(fù)制的起點，合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度，經(jīng)（變性、復(fù)性和延伸）三個階段為一個循環(huán)，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍，一般樣品經(jīng)過30次循環(huán)，最終使基因放大了數(shù)百萬倍；將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。