課程內容
《多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷》
一、基礎知識
(一)DNA分子的結構
1、組成元素
C、H、O、N、P
2、基本單位
脫氧核苷酸
3、脫氧核苷酸結構
脫氧核苷酸:磷酸
脫氧核苷:脫氧核糖
含氮堿基:嘌呤:腺嘌呤(A)
鳥嘌呤(G)
嘧啶:胞嘧啶(C)
胸腺嘧啶(T)
4、多脫氧核苷酸鏈的形成
一個核苷酸上的磷酸基團上的“-OH”和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羧基之間失去一分子水,形成磷酸二酯鍵,即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’、5’、;磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羧基“-OH”末端稱為3'端,而磷酸基團的末端稱為5'端
5、DNA分子的雙螺旋結構
①DNA分子是由兩條反相平行的(即一條鏈為3'-5',另一條鏈為5'-3')脫氧核苷酸鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結構
②脫氧核糖與磷酸交替連結,排列在外側,構成基本骨架;堿基排列在鏈的內側
③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結起來,形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律:即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對,鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對
6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算
規(guī)律:DNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等。任意兩個互補的堿基之間和相等即A=T,G=C。任意兩個不互補的堿基之和恒等,占堿基總數(shù)的50%。及:A+G=T+C=T+G=50%,(A+G)/(T+C)=(A+C)/(G+T)=(T+C)/(A+G)=1
規(guī)律二:在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補鏈的(A+G)/(T+C)的值互為倒數(shù)關系
規(guī)律三:DNA雙鏈中,一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的,也與整個DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等
(二)DNA分子的特性
1、穩(wěn)定性
在DNA分子雙螺旋結構的內側,通過氫鍵形成的堿基對,使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來。)
2、多樣性
構成DNA分子的堿基對的數(shù)量不同,堿基對的排列順序千變萬化
3、特異性
不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在差異,因此每一個DNA分子的堿基對都有其特點的排列順序,這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息,每一種生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的
(三)DNA的復制
1、概念
由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程
2、時期
有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期
3、場所
細胞核(主)、線粒體、葉綠體
4、模板
DNA母鏈
5、原材料
脫氧核苷酸
6、基本條件
酶、ATP、原料、模板
7、復制過程
①解旋
②合成
③復旋
①解旋提供準確模板
條件:ATP供能 解旋酶
解開的兩條單鏈叫母鏈(模板鏈)
②合成互補子鏈
模板:兩條母鏈
原料:游離的4種脫氧核苷酸
酶:合成酶
原則:堿基互補配對原則
③子、母鏈結合盤繞形成新DNA分子:
8、復制特點
邊解旋邊復制(過程)
半保留復制(結果)
9、遵循原則
堿基互補配對原則
10、精確復制的原因
①規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板
②堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行
11、復制的意義
DNA分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后代,從而保持了遺傳信息的連續(xù)性
(四)PCR(多聚酶鏈式反應)
1、DNA聚合酶特性
不能從頭合成DNA,只能從DNA的3'端開始延伸DNA鏈,因此,DNA復制需要引物
2、DNA聚合酶作用過程
當引物與DNS母鏈通過堿基互補配對結合后,DNA聚合酶就能從引物的3'端開始延伸DNA鏈,DNA的合成方向總是從子鏈的5'端向3'端延伸
3、PCR原理
①在80-100℃的溫度范圍內,DNA的雙螺旋結構將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性
②當溫度緩慢降低后,兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈
③PCR利用了DNA的熱變性原理,通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合,現(xiàn)在使用的PCR儀實質上也是一臺能夠自動調控溫度的儀器
4、Taq DNA聚合酶的應用
高溫解決了打開雙鏈的問題,但是,又導致DNA聚合酶失活的問題,耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題,促成了PCR技術的自動化
5、緩沖液需要為PCR反應提供的物質
DNA模板,分別與兩套模板鏈相結合的兩種引物,四種脫氧核苷酸,耐熱的DNS聚合酶,同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行
6、PCR技術的特點
PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好。易自動化等突出特點
7、細胞內和細胞外DNA復制環(huán)境的區(qū)別
體內DNA的復制 | 體外的模擬 | |
模板(母鏈) | 細胞內源 | 外源加入 |
引物 | 引物合成酶 | 外源加入 |
底物dNTP | 細胞內源 | 外源加入 |
聚合酶 | 細胞內源 | 外源加入 |
反應環(huán)境 | 細胞內環(huán)境 | 緩沖液 |
①PCR過程需要的引物一般是人工合成的DNA單鏈,其長度通常為20-30個脫氧核苷酸
②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的
(五)PCR的反應過程
1、PCR的反應步驟
PCR一般經歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為三個基本步驟——變性、復性和延伸
2、循環(huán)過程
①變性(模板DNA解旋)
模板DNA經加熱至90℃以上。一定時間后,使模板DNA雙鏈經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使成為單鏈,以便于它與引物結合,為下輪反應作準備
PCR循環(huán)第一步:加熱變性
②復性(退火)
模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降到50℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合
PCR循環(huán)第二步:引物與靶序列退火
③模板DNA-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料,以母鏈為模板,按堿基互補配對原則與半保留復制的原理,合成一條新的DNA鏈
PCR循環(huán)第三步:引物延伸
第一個PCR循環(huán)完成后:得到兩個拷貝的靶序列
3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量
4、PCR循環(huán)的結果
①從第二輪循環(huán)開始,上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合,進行Ⅰ的延伸
②DNA聚合酶只能在特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。
二、PCR的實驗操作
(一)設備及用具
1、PCR儀
實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器
2、微量離心管
一種薄壁塑料管,總容積為0.5ml
3、微量移液器
用于定量轉移PCR配方中的液體,其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次
(二)實驗操作步驟
1、準備
按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上
2、移液
用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑
3、混合
①過程:蓋嚴微量離心管口的蓋子,用手指輕輕彈擊管壁
②注意:A離心管口的蓋子一定蓋嚴,防止實驗中脫落或液體外溢
B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁,目的是使反應液混合均勻
4、;離心
①過程:將微量離心管放在離心機上,離心約10s
②離心目的:使反應液集中在離心管底部,提高反應效果
5、反應:
將離心管放入PCR儀上,設置好PCR儀的循環(huán)程序。
循環(huán)數(shù) | 變性 | 復性 | 延伸 |
第一次 | 94℃ 10min |
- | - |
30次 | 94℃ 30s |
55℃,30s | 72℃ 1min |
最后一次 | 94℃ 1min |
55℃,30s | 72℃ 1min |
PCR技術高度靈敏,為了避免外援DNA等因素的污染而造成干擾實驗,PCR操作時要注意做到:
①隔離操作區(qū):所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌;
②分裝試劑,簡化操作程序,使用一次性槍頭
三、課題成果評價
(一)理論上DNA擴增的計算
1、一條DNA,復制n次,DNA為2的n次方
2、a條DNA,復制n次,DNA為a乘以2的n次方
(二)實驗中1、一條DNA,復制n次,DNA為2的n次方含量的測定
1、原理
可以通過計算1、一條DNA,復制n次,DNA含量評價擴增的效果,DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰,峰值的大小與DNA的含量有關
2、過程
①稀釋
PCR反應液,加入98ul蒸餾水,即將樣品進行50倍稀釋
②對照凋零
以蒸餾水作為空白對照,在波長260nm處,將紫外分光光度計的讀數(shù)調至零
③計算
取DNA稀釋液100ul至比色杯中,測定260nm處的光吸收值
④計算
DNA含量(ug)=50×(260nm的讀數(shù))
×稀釋倍數(shù)
50:1ug/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02
五、實驗小結
PCR儀加熱使(模板)變性,復性使引物與模板DNA(互補),延伸需將反應溫度升至中溫(72℃),在(Taq聚合酶)的作用下,以四種脫氧核苷酸為原料,以(引物)為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,經(變性、復性和延伸)三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品經過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。